Núm. actual   Núm. anteriores   Actualidad   Investigación   Patrocinadores   Inicio


DOSSIER CIENTÍFICO


Biología sintética en busca de andamios

Mark Isalan y Yolanda Schaerli

Los campos precursores de la biología sintética son la biología molecular recombinante y la ingeniería de proteínas. Esta última genera, de manera rutinaria y mediante ingeniería racional y combinatoria, nuevas proteínas con funciones deseadas. Se discute aquí cómo han aplicado los conceptos más logrados de este campo a la biología de sistemas. Construir el equivalente conceptual de un «andamio» mediante ingeniería de redes y hallar métodos fiables que nos permitan predecir el resultado de combinar múltiples interacciones positivas y negativas. Si logramos superar estos impedimentos, tal vez entonces podremos empezar de verdad a construir de manera fiable redes génicas.


La biología sintética es un campo de investigación emergente que aplica enfoques propios de la ingeniería a los sistemas biológicos. Si revisamos las publicaciones científicas más recientes, encontramos titulares como «2011: ¿Año de la Biología Sintética?».1 Este tipo de editoriales citan invariablemente el trabajo de Craig Venter, en el que sintetizaba químicamente y transfería un genoma de Mycoplasma a una célula receptora. 2 El trabajo, que inspiró en todo el planeta noticias sobre la «creación de vida sintética», consiguió simultáneamente encender la imaginación colectiva y preocupar a la población. Y contribuyó, sin duda, a elevar enormemente el interés en la biología sintética (fig. 1).

Sin embargo, es bien sabido que la biología sintética afronta grandes dificultades técnicas. Por ejemplo, en el artículo que publicaba Nature en 2010, titulado Five hard truths for synthetic biology,3 se mencionan algunos de los problemas de este campo, como el que las «partes» biológicas no necesariamente encajan entre ellas como piezas de Lego,4 y que se requiere la contribución de muchas personas durante muchos años para crear una ruta de tan solo una docena de pasos.5 Sin embargo, más que insistir en los aspectos negativos, en este ensayo consideraremos cómo superar estas dificultades, comentando lo que se debe hacer, teórica y prácticamente, para hacer que las estrategias en ingeniería de redes génicas sean más fiables.

Figura 1

Figura 1. Búsqueda de synthetic biology en Google Trends
El volumen de consultas en este motor de búsqueda (gráfica superior) y el de consultas de las noticias de referencia (gráfica inferior) muestran picos esporádicos pero crecientes de interés del público en el curso del tiempo. Hasta la segunda mitad de 2008, los volúmenes de consultas no solían exceder el umbral de detección del algoritmo de Google Trends, y a partir de este momento se mantuvieron relativamente estables. El mayor pico (D) correspondía al día siguiente a la publicación de un artículo muy difundido de Science2 acerca de la síntesis química y transferencia del genoma de una bacteria del género Mycoplasma. [
Fuente: Google Trends]



Reciclando las mismas partes

Si echamos un vistazo a los principales artículos sobre biología sintética, vemos que un mismo puñado de componentes biológicos es usado una y otra vez. Por ejemplo, retroalimentaciones negativas (TetR),6 interruptores génicos (LacI, λ cI, TetR),7 el represilador (TetR, LacI, λ cI),8 las redes combinatorias (TetR, LacI, λ cI),9 el oscilador de Atkinson (LacI, GlnA, GlnG, NRI),10 el interruptor biestable de selección de atractores (TetR, LacI)11 y la red emisor–receptor de detección de banda (LacI, λ cI, LuxR, LuxI),12 usan todos ellos componentes relacionados. Si nos detenemos en este último ejemplo, la mayoría de los circuitos sintéticos de comunicación entre células que existen han sido diseñados utilizando elementos de sistemas de autoinducción. 12-16 Podemos citar más ejemplos (revisados en Michalodimitrakis e Isalan),17 pero la observación general es que los diseños de mayor éxito se consiguen reciclando las mismas partes.

Pero, ¿por qué es tan frecuente el uso de las mismas partes? En cierto modo, se debe a que están bien caracterizadas y poseen relativamente pocas funciones modulares (por ejemplo, añadiendo sitios del operador lac a un nuevo promotor se le puede hacer susceptible a la represión, aunque precise aún una cierta sintonización previa).18 Otros componentes modulares, como las RNA polimerasas de T7 o SP6, pueden ver también sus actividades transferidas de un constructo a otro añadiendo unas secuencias diana relativamente cortas. Por tanto, se prestan a una reingeniería sintética un tanto flexible.19,20 Con el fin de ampliar este repertorio de componentes, el MIT ha puesto recientemente en marcha un Registro de Partes Biológicas Estándar, basado en el concepto de biobrick o ladrillo biológico.4 Este sistema pretende estandarizar la clonación, y es el más utilizado en el concurso iGEM (por las siglas en inglés de International Genetically Engineered Machine, o Máquina Internacional creada por Ingeniería Genética),21 en el que estudiantes universitarios de todo el mundo diseñan y construyen sistemas biológicos sintéticos. A pesar de ser una fuente útil de secuencias de DNA funcionales, la relativa falta de literatura generada por este repositorio da fe del hecho que los componentes biológicos, situados simplemente uno junto a otro, no siempre se comportan como es predecible. La trampa se halla a menudo en los detalles, en aquellos efectos menores que dependen del contexto.

Ingeniería de proteínas, la precursora de la biología sintética

Las bases de la biología sintética son la clonación molecular y las tecnologías de DNA recombinante, en las que componentes genéticos como los promotores de transcripción y las regiones codificantes se combinan de manera rutinaria para crear nuevos plásmidos o constructos para la expresión de proteínas.22 La idea de construir redes sintéticas de genes es, probablemente, un nivel más de complejidad, en el que simplemente se engarzan los constructos recombinanes apropiados para crear redes.

Sin embargo, a causa de los efectos impredecibles mencionados anteriormente, no siempre es sencillo combinar partes o mutaciones entre ellas para generar nuevas funciones. La ingeniería de proteínas es un campo de ingeniería biológica que se encuentra a día de hoy relativamente maduro, y en el que se crean nuevos constructos funcionales de manera rutinaria. Se diseñan nuevas proteínas, utilizando a menudo información estructural y un elemento de diseño racional.23,24 y también seleccionando los elementos a partir de extensas bibliotecas combinatorias aleatorias. Son particularmente poderosos los métodos de evolución dirigida que conectan el fenotipo con el genotipo, y que añaden un elemento de selección darwiniana.25 En sistemas de selección como la presentación en fagos26,27 se pueden exponer sobre la superficie de los fagos millones de fragmentos de anticuerpos al azar. La variante «una entre un millón» con la actividad vinculante deseada puede unirse a su diana, sobrevivir al posterior lavado, e infectar nuevas células huésped. Aquí, sobreviven los que han adquirido la nueva función deseada.

Andamios para la ingeniería de redes

La falta de un «andamio» claro sobre el cual poder unir al azar los componentes de la red es uno de los factores que dificulta en gran medida la aplicación de la selección a la ingeniería de redes. La palabra andamio tiene aquí un significado específico, siendo su propiedad clave que esta estructura debe soportar amplias mutaciones sin perder su funcionalidad global. En ingeniería de proteínas, un andamio típico, como puede ser un dedo de cinc, puede ser mutado simultáneamente en prácticamente todos sus residuos (excepto en aquellos clave para su plegamiento), y seguir plegándose correctamente.28 Por ello, es mayor la probabilidad de éxito en la generación de nuevas funciones cuando se pueden introducir aleatorizaciones en la biblioteca que si tenemos un andamio frágil con respecto a las mutaciones.29 Es interesante constatar que hay trabajos teóricos formales que abordan este efecto: la capacidad evolutiva es mayor en sistemas robustos como son los andamios de motivos proteicos.30

La principal cuestión que queda por resolver es definir un andamio robusto de redes para la biología sintética. La arquitectura del vector no es en sí misma un problema; deberían bastar los sistemas habituales de clonación de plásmidos con enzimas de restricción para insertar casetes de bibliotecas al azar.9 La cuestión consiste en dónde se debe introducir la diversidad combinatoria. Por ejemplo, cuando se están construyendo redes sintéticas de transcripción sería una pérdida de tiempo aleatorizar todos los residuos de los factores de transcripción (TF); la mayoría de mutantes no serían funcionales o tendrían funciones similares, y la biblioteca pronto sería demasiado extensa para cribarla. En cambio, sería más apropiado introducir mutaciones racionales cerca del lugar de unión del TF al DNA para modular su afinidad. Por tanto, las mutaciones dirigidas proporcionarían diversidad funcional a una librería relativamente reducida y fácil de gestionar. Podrían también modificarse algunos parámetros moduladores, como la vida media o el número de copia del sitio de unión, como parte de un andamio de redes robusto y aleatorizado. Numerosas opciones prácticas son posibles (fig. 2).

Figura 2

Figura 2. Andamios para la ingeniería de redes
A) Esquema de un interruptor génico construido a partir de una red de dos nodos que se inhiben mutuamente. Se utilizan inductores para pasar de un estado estable al otro.7
B) El interruptor se puede codificar en dos plásmidos, cada uno de ellos transportando un origen de replicación (ori), un gen de resistencia a antibióticos, un promotor (P), un represor con una etiqueta de degradación, un sitio de unión a represor (BS) y sitios de unión a ribosomas (RBS). Este andamio podría ser aleatorizado en las posiciones indicadas por las flechas rojas. Cinco variaciones en cada posición generarían una biblioteca combinatoria de casi 107 miembros. Estas variaciones codificarían parámetros (como la fuerza de unión) suficientes para cubrir un rango adecuado de posibilidades, por ejemplo fuerzas reducida, media o elevada, o un rango que cubriera diversos órdenes de magnitud. Se podría usar un marcador para identificar las redes portadoras del carácter deseado mediante selecciones consecutivas en los estados ON y OFF.31-33



Un segundo aspecto es cómo aplicar una presión selectiva darwiniana al andamio de la red aleatoria. Se han construido redes de genes con combinaciones aleatorias,9 pero se han debido cribar individualmente más que aplicar una presión selectiva para seleccionar las variantes raras con las propiedades deseadas. Hay varias posibilidades para convertir un andamio de redes en un sistema selectivo funcional. Una de ellas es vincular a la red un gen de supervivencia, como la resistencia a antibióticos, o de complementación para un mutante metabólico.11 Tal vez un diseño aún más elegante sea utilizar marcadores duales de selección y contraselección, cuya expresión permita la supervivencia de la célula o induzca la muerte celular en condiciones determinadas.31-33

Nosotros mismos y otros grupos estamos implementando estos marcadores con el objeto de seleccionar redes con propiedades determinadas. Por ejemplo, la presión selectiva sobre un conmutador, en respuesta a un factor ambiental determinado, podría ser una selección positiva para la expresión en condiciones ON y negativa en OFF. Podríamos imaginar varias rondas de selección condicional para obtener comportamientos más complejos fruto de la relación entrada–salida. Ciertas presiones selectivas propiciarían la conmutación de manera relativamente sencilla.32 Sin embargo, para crear pautas complejas como los lunares o rayas regulares encontrados en los patrones Turing o Gierer-Meinhardt,34,35 el sistema de selección podría ser bastante más complicado. Si fuéramos capaces de diseñar un andamio de biblioteca robusto, basado en algunos motivos de feedback positivo y negativo,36 podríamos imaginar un sistema de criba automatizada para el comportamiento deseado (fig. 3). Sin embargo, ello sigue siendo un enorme desafío para la comunidad de la biología sintética.

Figura 3

Figura 3. Selección automatizada de patrones espaciales en un andamio de red
El esquema muestra un complejo experimento para cribar una biblioteca combinatoria de andamios en busca de un sistema Gierer-Meinhardt.42 Se deberían analizar miles de candidatos aleatorizados para identificar el comportamiento correcto. La biblioteca incluiría variantes de un activador (U; en naranja) y un inhibidor (V; en azul) que comunicarían una activación local, no lineal, y señales inhibidoras de largo alcance dirigidas a otras células. Serían precisas aleatorizaciones para codificar variaciones en parámetros como la potencia de activación e inhibición, vida media de los componentes, o tasas de secreción y difusión. Sembrando los miembros de las bibliotecas en placas de Petri o en placas multipocillos (uno por placa) se pueden cribar miles de parámetros aleatorizados en busca del potencial comportamiento de generación de patrones.



Predicción de los efectos de integrar múltiples inputs

Uno de los principales obstáculos con los que se topan los biólogos sintéticos es cómo codificar múltiples inputs en un mismo nodo de una red. Por ejemplo, cuando echamos un vistazo a la lógica de las redes génicas de desarrollo, a menudo tienen más de una interacción positiva y negativa controlando cada gen, incluyendo los feedbacks. Aunque, mediante ingeniería inversa, podamos seguir en parte la lógica que hay tras ello,37 el enfoque de la ingeniería en la biología sintética es mucho más difícil de implementar. ¿Qué ocurre cuando un gen se halla bajo el control de dos activadores y dos represores sintéticos? Normalmente se hace difícil de predecir, y factores como la competencia pueden tener efectos significativamente distintos.38 Hasta cierto punto, si utilizamos estrategias combinatorias con las presiones selectivas adecuadas, algunos de estos dilemas se resuelven por sí mismos, incluso si no comprendemos de antemano las redes resultantes. No obstante, sería un enorme avance entender la lógica de la red desde una perspectiva de ingeniería.39

Redes distribuidas

El número de componentes bien caracterizados es reducido, por lo que, aunque supiéramos construir complejas regiones reguladoras, pronto nos quedaríamos sin componentes únicos a la hora de construir redes mayores. Un estudio reciente soslayó ambos problemas, la limitación en el número de piezas y la integración de múltiples inputs, mediante un diseño elegante. Distribuyendo de manera combinatoria puertas lógicas de gran simplicidad en poblaciones heterogéneas de células, cada una de ellas era portadora de una función simple. Sin embargo, el conjunto de ellas podía llevar a cabo tareas computacionales distribuidas de modo mucho más complejo.40 Una idea similar consistía en utilizar múltiples colonias de función única y comunicarlas entre sí para crear puertas lógicas mucho más complejas.41 Tal vez este concepto representa un andamio de red alternativo y es realmente el futuro de la biología sintética.

En esta breve revisión hemos buscado las raíces de la biología sintética en la ingeniería de proteínas, hemos comentado métodos para implementar conceptos de selección combinatoria, y hemos mencionado los problemas de ingeniería a los que nos enfrentamos. Estamos lejos de poseer un método robusto de ingeniería para sistemas biológicos, pero tal vez parte de la diversión es construir para tratar de comprender.



Agradecimientos
El grupo de Mark Isalan está financiado por el European Research Council, FP7-ERC-201249-ZINC-HUBS, el acuerdo MEC-EMBL y por la beca MICINN BFU2010-17953 del Ministerio de Ciencia e Innovación. Yolanda Schaerli posee una beca de la Swiss National Science Foundation (SNSF).

Bibliografía
1. Schaefer U.: «2011 - Year of Synthetic Biology?». BiotecVisions 2011 A1; DOI: 10.1002/biot.201000456.
2. Gibson D.G., Glass J.I., Lartigue C., Noskov V.N., Chuang R.Y. et al.: «Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome». Science 2010; 329: 52-6.
3. Kwok R.: «Five hard truths for synthetic biology. Nature 2010; 463: 288-90.
4. Knight T.F.: Idempotent Vector Design for Standard Assembly of BioBricks. Tech rep, MIT Synthetic Biology Working Group Technical Reports, 2003.
5. Ro D.K., Paradise E.M., Ouellet M., Fisher K.J., Newman K.L. et al.: «Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast». Nature 2006; 440: 940-3.
6. Becskei A., Serrano L.: «Engineering stability in gene networks by autoregulation». Nature 2000; 405: 590-3.
7. Gardner T.S., Cantor C.R., Collins J.J.: «Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli». Nature 2000; 403: 339-42.
8. Elowitz M.B., Leibler S.: «A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators». Nature 2000; 403: 335-338.
9. Guet C.C., Elowitz M.B., Hsing W., Leibler S.:«Combinatorial synthesis of genetic Networks». Science 2002; 296: 1466-70.
10. Atkinson M.R., Savageau M.A., Myers J.T., Ninfa A.J.: «Development of genetic circuitry exhibiting toggle switch or oscillatory behavior in Escherichia coli». Cell 2003; 113: 597-607.
11. Kashiwagi A., Urabe I., Kaneko K., Yomo T.: «Adaptive response of a gene network to environmental changes by fitness-induced attractor selection». PLoS One 2006; 1: e49.
12. Basu S., Gerchman Y., Collins C.H., Arnold F.H., Weiss R.: «A synthetic multicellular system for programmed pattern formation». Nature 2005; 434: 1130-4.
13. Basu S., Mehreja R., Thiberge S., Chen M.T., Weiss R.: «Spatiotemporal control of gene expression with pulse-generating Networks». Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 6355-60.
14. Brenner K., Karig D.K., Weiss R., Arnold F.H.: «Engineered bidirectional communication mediates a consensus in a microbial biofilm consortium». Proc Natl Acad Sci USA 2007; 104: 17300-4.
15. You L., Cox R.S. 3rd, Weiss R., Arnold F.H.: «Programmed population control by cell-cell communication and regulated killing». Nature 2004; 428: 868-71.
16. Bulter T., Lee S.G., Wong W.W., Fung E., Connor M.R. et al.:«Design of artificial cell-cell communication using gene and metabolic Networks». Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101: 2299-304.
17. Michalodimitrakis K., Isalan M.: «Engineering prokaryotic gene circuits». FEMS Microbiol Rev 2009; 33: 27-37.
18. Weiss R., Basu S.: The Device Physics of Cellular Logic Gates. First Workshop on Non-Silicon Computing, Feb 2002: 1-8.
19. Noireaux V., Bar-Ziv R., Libchaber A.: «Principles of cell-free genetic circuit assembly». Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 12672-7.
20. Isalan M., Lemerle C., Serrano L.: «Engineering gene networks to emulate Drosophila embryonic pattern formation». PLoS Biol 2005; 3: e64.
21. Goodman C.: «Engineering ingenuity at iGEM». Nat Chem Biol 2008; 4: 13.
22. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
23. Kuhlman B., Dantas G., Ireton G.C., Varani G., Stoddard B.L. et al.: «Design of a novel globular protein fold with atomic-level accuracy». Science 2003; 302: 1364-8.
24. Fleishman S.J., Whitehead T.A., Ekiert D.C., Dreyfus C., Corn J.E. et al.: «Computational design of proteins targeting the conserved stem region of influenza hemagglutinin». Science 2011; 332: 816-21.
25. Griffiths A.D., Tawfik D.S.: «Directed evolution of an extremely fast phosphotriesterase by in vitro compartmentalization». EMBO J 2003; 22: 24-35.
26. Smith G.P.: «Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface». Science 1985; 228: 1315-1317.
27. Winter G., Griffiths A.D., Hawkins R.E., Hoogenboom H.R.: «Making antibodies by phage display technology». Annu Rev Immunol 1994; 12: 433-55.
28. Michael S.F., Kilfoil V.J., Schmidt M.H., Amann B.T., Berg J.M.: «Metal binding and folding properties of a minimalist Cys2His2 zinc finger peptide». Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: 4796-800.
29. Tokuriki N., Tawfik D.S.: «Chaperonin overexpression promotes genetic variation and enzyme evolution». Nature 2009; 459: 668-73.
30. Wagner A.: «Robustness, evolvability, and neutrality». FEBS Lett 2005; 579: 1772-8.
31. Nomura Y., Yokobayashi Y.: «Dual selection of a genetic switch by a single selection marker». Biosystems 2007; 90: 115-20.
32. Muranaka N., Sharma V., Nomura Y, Yokobayashi Y.: «An efficient platform for genetic selection and screening of gene switches in Escherichia coli». Nucleic Acids Res 2009; 37: e39.
33. Tashiro Y., Fukutomi H., Terakubo K., Saito K., Umeno D.: «A nucleoside kinase as a dual selector for genetic switches and circuits». Nucleic Acids Res 2011; 39: e12.
34. Turing A.M.: «The chemical basis of morphogenesis». Philosophical Transactions of the Royal Society of London B 1952; 237: 37-72.
35. Gierer A., Meinhardt H.: «A theory of biological pattern formation». Kybernetik 1972; 12: 30-9.
36. Isalan M.: «Gene networks and liar paradoxes». Bioessays 2009; 31: 1110-5.
37. Jaeger J., Surkova S., Blagov M., Janssens H., Kosman D. et al.: «Dynamic control of positional information in the early Drosophila embryo». Nature 2004; 430: 368-71.
38. Munteanu A., Constante M., Isalan M., Solé R.V.: «Avoiding transcription factor competition at promoter level increases the chances of obtaining oscillation». BMC Syst Biol 2010; 4: 66.
39. Alon U.: An Introduction to Systems Biology: Design Principles of Biological Circuits. Londres: CRC Press, 2006.
40. Regot S., Macia J., Conde N., Furukawa K., Kjellen J. et al.: «Distributed biological computation with multicellular engineered Networks». Nature 2011; 469: 207-11.
41. Tamsir A., Tabor J.J., Voigt C.A.: «Robust multicellular computing using genetically encoded NOR gates and chemical 'wires'». Nature 2011; 469: 212-5.
42. Meinhardt H., Gierer A.: «Pattern formation by local self-activation and lateral inhibition». Bioessays 2000; 22: 753-60.


Mark Isalan y Yolanda Schaerli
Unidad de Investigación en Biología de Sistemas
Centro de Regulación Genómica (CRG) y UPF
Barcelona




ARTÍCULOS DE ESTE DOSSIER
[Marzo 2012]

INTRODUCCIÓN: La biología sintética
Luis Serrano

Biología sintética, Gödel y el relojero ciego
Andrés Moya

La nueva frontera de la biotecnología: genomas sintéticos y microorganismos no naturales
Víctor de Lorenzo

Biología sintética en busca de andamios
Mark Isalan y Yolanda Schaerli

[VOLVER AL ÍNDICE]

 




ISSN: 1696-4837
© SEBBM. SEBBM es una publicación periódica de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular.
© Rubes Editorial.